一、介紹

在科學(xué)進(jìn)步和希望利用這些進(jìn)步的新投資的推動(dòng)下，研究人員和臨床醫(yī)生正在開發(fā)創(chuàng)新的細(xì)胞療法。出于兩個(gè)原因，控制此類治療制劑中的內(nèi)毒素污染非常重要。首先，由于內(nèi)毒素會(huì)對(duì)受體產(chǎn)生影響，因此給患者注射的制劑不能受到嚴(yán)重污染。其次，內(nèi)毒素是多種細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑，可能會(huì)改變細(xì)胞的治療價(jià)值。

二、細(xì)胞療法解析

以細(xì)胞和組織為基礎(chǔ)的療法（本文中稱為細(xì)胞療法）是一種特殊的腸外產(chǎn)品，其中給患者注射的是活細(xì)胞。細(xì)胞可以來(lái)自患者（自體），這樣可以防止對(duì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)。另一種方法是從另一個(gè)人身上采集細(xì)胞（異體來(lái)源），在這種情況下，供體組織可能與受體匹配，以減少對(duì)療法的免疫反應(yīng)，但這種療法通常需要使用免疫抑制藥物。第三種方法是使用異種細(xì)胞（從其他物種獲得的細(xì)胞），這可能也需要使用免疫抑制藥物。

將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中用于后續(xù)的儲(chǔ)存、生長(zhǎng)、操作、轉(zhuǎn)化或收獲（以及其任何組合）。在簡(jiǎn)單的治療形式中，細(xì)胞無(wú)需對(duì)之前收獲的自身細(xì)胞進(jìn)行任何操作即可返回患者體內(nèi)。這通常是在治療減少淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行的。對(duì)于其他療法，可以在使用之前操作或刺激所使用的細(xì)胞或組織。

細(xì)胞療法可以通過輸注藥物、注射或手術(shù)植入，以聚集形式或具有支撐或封裝材料，可被視為醫(yī)療器械的物品。供者（通常是患者）體內(nèi)的細(xì)胞通常是無(wú)菌的，并且不含可檢測(cè)到的內(nèi)毒素。令人擔(dān)憂的是，它們?cè)谑占?chǔ)存、操作（如果適用）和返回患者體內(nèi)的過程中會(huì)受到污染。

三、內(nèi)毒素的意義

內(nèi)毒素是一種有效的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。如果在細(xì)胞治療中作為污染物存在，可能會(huì)影響患者和/或被施用的細(xì)胞。第一個(gè)問題是對(duì)患者的潛在影響，這對(duì)于接觸血液、淋巴系統(tǒng)或腦脊液的其他注射產(chǎn)品和醫(yī)療器械來(lái)說(shuō)很常見。這些產(chǎn)品穿透或繞過皮膚和腸壁的保護(hù)屏障，有可能將內(nèi)毒素直接引入血液。通過口腔攝入的內(nèi)毒素通常不會(huì)對(duì)健康造成有害影響，因?yàn)樗粫?huì)穿過腸壁進(jìn)入血液。內(nèi)毒素是由口腔和腸道中的細(xì)菌產(chǎn)生的；它存在于食物和自來(lái)水中，有時(shí)濃度超過1000EU/mL。相反，內(nèi)毒素如果進(jìn)入血液，會(huì)引起發(fā)燒（熱原反應(yīng)）和一系列其他可能的影響，包括感染性休克和死亡，這是危險(xiǎn)的。因此，將治療劑直接引入患者血液的治療方法，如注射、輸注或作為醫(yī)療設(shè)備，必須控制內(nèi)毒素污染。

第二個(gè)考慮因素是內(nèi)毒素對(duì)待給藥細(xì)胞的影響。內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞的影響在《LAL更新》第16卷第1期生物技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行了討論。同樣的原理也適用于細(xì)胞治療。關(guān)注的影響包括有絲分裂的誘導(dǎo)、細(xì)胞因子的刺激產(chǎn)生（細(xì)胞因子本身可能是熱原性的）、形態(tài)變化和細(xì)胞毒性。因此，在存在內(nèi)毒素的情況下，所給藥的細(xì)胞的性質(zhì)可能與預(yù)期的不同。這種污染可能導(dǎo)致治療失敗，正如Vargas等人1在胰島移植的情況下提出的那樣。

沒有太多的法規(guī)和指導(dǎo)文件專門針對(duì)細(xì)胞治療的內(nèi)毒素污染。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）文件《人類體細(xì)胞治療和基因治療指南》提出了幾點(diǎn)。2內(nèi)毒素檢測(cè)要求與其他胃腸外產(chǎn)品的要求一致。在第III部分：細(xì)胞基因治療產(chǎn)品的特性和釋放測(cè)試中，法規(guī)指出最終產(chǎn)品和生產(chǎn)過程和使用的材料應(yīng)經(jīng)過QC測(cè)試。在“純度"（B部分）標(biāo)題下，該文件建議驗(yàn)證用于檢測(cè)內(nèi)毒素的合適的LAL測(cè)試方法。也就是說(shuō)，必須證明所測(cè)試的細(xì)胞制劑不會(huì)干擾LAL測(cè)試檢測(cè)內(nèi)毒素的能力。該指南引用了美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局1983年的《鱟試劑裂解物試驗(yàn)驗(yàn)證指南》。第八節(jié)：“臨床前評(píng)估……"未提及內(nèi)毒素（LAL）檢測(cè)或熱原（兔子）檢測(cè)。在這個(gè)階段可能會(huì)考慮熱原測(cè)試，但指南中沒有說(shuō)明。由于許多細(xì)胞療法產(chǎn)生熱原性細(xì)胞因子，熱原檢測(cè)呈陽(yáng)性可能不表明內(nèi)毒素污染。

歐洲藥品評(píng)估機(jī)構(gòu)（EMEA）于2001年發(fā)布了“關(guān)于人類體細(xì)胞治療藥品生產(chǎn)和質(zhì)量控制的考慮要點(diǎn)"4。在標(biāo)題“其他材料和試劑的來(lái)源和特性"下，聲明“應(yīng)確保輔助產(chǎn)品的低內(nèi)毒素水平"。在給藥之前，沒有關(guān)于使用LAL的細(xì)胞治療產(chǎn)品的釋放測(cè)試的具體聲明。

四、實(shí)際考慮

未稀釋的細(xì)胞懸浮液可能會(huì)干擾光度法（比濁法和顯色法）。因此，du Moulin和同事5使用凝膠凝塊法檢測(cè)外周血單核細(xì)胞，然后再將其送回患者體內(nèi)進(jìn)行自淋巴細(xì)胞治療。這些作者對(duì)作為細(xì)菌污染指標(biāo)的內(nèi)毒素的潛力很感興趣。在隨后的一篇論文6 中，該研究小組介紹了一種光度（顯色）測(cè)定法的驗(yàn)證情況。

不同類型的細(xì)胞制劑可能具有不同的干擾特性。此外，來(lái)自不同供體的相同類型的細(xì)胞制劑也可能具有不同的抑制（或增強(qiáng)）模式。為了解決這些可能的差異，方法開發(fā)應(yīng)該產(chǎn)生一個(gè)堅(jiān)固的測(cè)試，以便通過對(duì)干擾因素進(jìn)行測(cè)試，可以對(duì)三個(gè)不同批次的治療制劑（最好使用來(lái)自三個(gè)不同來(lái)源的細(xì)胞）進(jìn)行測(cè)試驗(yàn)證。盡管盡了最大努力來(lái)開發(fā)一種堅(jiān)固的測(cè)試，但可能仍然有必要在測(cè)試程序中建立靈活性，以克服來(lái)自麻煩樣本的干擾。如果克服干擾需要改變樣品的處理方式，則當(dāng)超過原始驗(yàn)證的參數(shù)時(shí)，應(yīng)對(duì)修改后的處理方式進(jìn)行干擾因素測(cè)試。

另一個(gè)實(shí)際考慮因素是（1,3）-β-D-葡聚糖污染可能導(dǎo)致LAL檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性（即無(wú)內(nèi)毒素）。Anderson等人7報(bào)道了用于HIV免疫臨床試驗(yàn)的自體樹突狀細(xì)胞LAL凝膠凝塊試驗(yàn)呈陽(yáng)性。在這種情況下，污染源被證明是硝酸纖維素過濾器。與內(nèi)毒素一樣，葡聚糖是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，但在任何藥典或監(jiān)管文件中都沒有對(duì)葡聚糖的限制。因此，葡聚糖有可能影響細(xì)胞療法的性質(zhì)和/或影響該療法的接受者。FDA規(guī)定，LAL檢測(cè)陽(yáng)性（不合格）的結(jié)果必須被認(rèn)為是不合格的，除非有其他證明。葡聚糖特異性LAL試劑（Glucatell，ACC目錄號(hào)GT002）和葡聚糖特異性LA測(cè)試（使用Gluchield葡聚糖阻抑制沖液，ACC目錄編號(hào)GB0051）可以幫助區(qū)分內(nèi)毒素和葡聚糖污染。建議對(duì)纖維素過濾器進(jìn)行葡聚糖測(cè)試，以避免LAL測(cè)試呈陽(yáng)性以及葡聚糖對(duì)細(xì)胞的可能影響。

檢測(cè)細(xì)胞療法中的內(nèi)毒素是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)樗鶞y(cè)試的材料可能隨著供體的血液化學(xué)而變化。在對(duì)患者進(jìn)行細(xì)胞治療之前，執(zhí)行LAL以提供結(jié)果的技術(shù)人員經(jīng)常面臨緊迫的時(shí)間壓力。因此，重要的是，測(cè)試方法要堅(jiān)固耐用，不易受到干擾，因?yàn)楦蓴_會(huì)導(dǎo)致測(cè)試無(wú)效，需要重復(fù)測(cè)試。稀釋樣品的能力對(duì)于獲得準(zhǔn)確的內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要。光度法明顯比凝膠凝塊法更靈敏，最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）也大大提高。因此，這些方法可以對(duì)樣品進(jìn)行更大程度的稀釋，以克服干擾和減少懸浮細(xì)胞造成的渾濁。使用Pyros Kinetix® Flex96細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)系統(tǒng)的光度技術(shù)的儀器和試劑，在中國(guó)大陸可聯(lián)系科德角國(guó)際購(gòu)買美國(guó)ACC產(chǎn)品。Pyros Kinetix® Flex細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)系統(tǒng)是可用的靈敏的內(nèi)毒素檢測(cè)系統(tǒng)，它提供了最大的MVD和稀釋范圍，以克服干擾。

Pyros Kinetix® Flex細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)系統(tǒng)

五、結(jié)論

適用于腸外產(chǎn)品或醫(yī)療器械內(nèi)毒素檢測(cè)的原則同樣適用于細(xì)胞療法。關(guān)于內(nèi)毒素對(duì)接受者的影響也有類似的擔(dān)憂，這推動(dòng)了合規(guī)性要求。然而，活細(xì)胞治療帶來(lái)了額外的風(fēng)險(xiǎn)，即內(nèi)毒素可能會(huì)影響細(xì)胞的特性及其治療價(jià)值。由于這兩個(gè)原因，細(xì)胞療法的內(nèi)毒素檢測(cè)是非常重要的。由于內(nèi)毒素可能會(huì)改變細(xì)胞的特性，強(qiáng)烈建議從潛在治療研究的早期階段開始監(jiān)測(cè)內(nèi)毒素污染。此外，對(duì)內(nèi)毒素控制重要性的早期認(rèn)識(shí)將確保在轉(zhuǎn)移到cGMP生產(chǎn)過程中時(shí)，也會(huì)轉(zhuǎn)移關(guān)于內(nèi)毒素控制的適當(dāng)考慮。

參考文獻(xiàn):

1.Vargas, Francesca ； Vives-Pi, Marta ； Somoza, Nuria ； Armengol, Pilar； Alcalde, Laura； Marti, Merce； Costa, Manuela； Serradell, Laurence； Dominguez, Orlando； Fernandez-Llamazares, Jaume； Julian, Joan F.； Sanmarti, Anna； Pujol-Borrell, Ricardo. 1998. Endotoxin contamination may be responsible for the unexplained failure of human pancreatic islet transplantation. Transplantation. 65（5）:722-727.

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4.“Points to Consider on the Manufacture and Quality Control of Human Somatic Cell Therapy Medicinal Products." European Agency for the Evaluation of Medicinal Products （EMEA）, London, 2001.

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