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答疑解惑丨細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)常見問(wèn)題解答第一彈!

發(fā)布時(shí)間: 2024-11-25  點(diǎn)擊次數(shù): 911次

在進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)的過(guò)程中,技術(shù)人員常面臨各種挑戰(zhàn)與疑問(wèn),為解決這些問(wèn)題,科德角國(guó)際匯總了客戶咨詢的常見問(wèn)題,并以詳盡的問(wèn)答形式提供了指導(dǎo)性的解答,為相關(guān)從業(yè)者提供參考。

一、如何溶解細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品?

對(duì)于不同類型的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品,其溶解方法有所不同。

??美國(guó)藥典USP細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(USP-RSE):加入5mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用水(2000EU/mL),再劇烈渦旋30分鐘。

??科德角國(guó)際歐洲藥典細(xì)菌內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品(BRP):將5mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用水添加到小瓶中。使用渦旋混合器間歇混合30分鐘以復(fù)溶,以獲得初始濃度2000EU/mL的儲(chǔ)備溶液。


歐洲藥典細(xì)菌內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品

▲歐洲藥典細(xì)菌內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品

??科德角國(guó)際ACC細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE-E0005):加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用水使細(xì)菌內(nèi)毒素初始濃度達(dá)到1000EU/mL(具體濃度參考試劑CoA),劇烈渦旋1分鐘,靜置5分鐘,重復(fù)5次以充分溶解。


細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)

▲細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE

二、中國(guó)藥典下的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品選擇

在中國(guó)藥典的規(guī)定下,進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí)應(yīng)使用藥典規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品,包括USP-RSE、EP-BRPCSE以及中國(guó)食品藥品檢定研究院的細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。

三、凝膠法、濁度法、顯色法的區(qū)別

凝膠法主要用于半定量分析,而顯色法和濁度法則用于定量分析。

顯色法和濁度法雖然大體相似,但在檢測(cè)原理、檢測(cè)波長(zhǎng)、檢測(cè)試劑、檢測(cè)范圍以及檢測(cè)成本上均存在差異,因此在選擇這兩種方法之前,需要根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行審慎而合理的考量。

當(dāng)凝膠法、顯色法和濁度法的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)疑問(wèn)或爭(zhēng)議時(shí),應(yīng)以凝膠法的結(jié)果作為最終的判定依據(jù)。

四、檢測(cè)時(shí)必須使用檢測(cè)專用耗材嗎?

在進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí),雖然不必使用專用的檢測(cè)耗材,但必須使用不含細(xì)菌內(nèi)毒素或β-葡聚糖的器具。

玻璃器具可通過(guò)超過(guò)250℃的干熱滅菌30分鐘以上來(lái)滅活細(xì)菌內(nèi)毒素,同時(shí)需避免使用可能釋放微量金屬離子(如Fe、Al、Ga、Cr等)影響檢測(cè)結(jié)果的金屬器具。

此外,對(duì)于一次性塑料器具,除需獲得生產(chǎn)商的保證外,還應(yīng)確認(rèn)其不受細(xì)菌內(nèi)毒素污染、不吸附細(xì)菌內(nèi)毒素,且洗脫物不含影響檢測(cè)結(jié)果的物質(zhì)。

五、胃腸道外給藥細(xì)菌內(nèi)毒素的限值確定

對(duì)于藥典中未規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素限值的樣品,其限值公式如下:

內(nèi)毒素限值(EU/mL)= K(EU/kg)/人最大給藥量(mL/kg)

其中,K值根據(jù)給藥途徑的不同而有所差異。

頻繁或連續(xù)注射時(shí),人最大給藥量為1小時(shí)內(nèi)注射的最大劑量。

??參考

日本、美國(guó)、歐洲藥典規(guī)定的K值(致熱細(xì)菌內(nèi)毒素量)

日本、美國(guó)、歐洲藥典規(guī)定的K值(致熱細(xì)菌內(nèi)毒素量)


六、如何計(jì)算MVD(最大有效稀釋率)?

計(jì)算公式如下:

MVD(最大有效稀釋率)計(jì)算公式.png


?? λ:凝膠法中表示鱟試劑的標(biāo)示靈敏度,光度法中表示細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的最小濃度。

此外,科德角國(guó)際的Pyros Kinetix® Flex細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)系統(tǒng)配套軟件“PEXS"帶有MVD自動(dòng)計(jì)算功能,方便用戶進(jìn)行快速準(zhǔn)確的計(jì)算。


Pyros Kinetix® Flex細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)系統(tǒng)

Pyros Kinetix® Flex細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)系統(tǒng)

七、不溶于水的樣品檢測(cè)?

對(duì)于不溶于水的樣品,如果能溶于1%乙醇或1%DMSO,在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)不會(huì)對(duì)鱟試劑造成影響。

八、樣品保存方法?

保存樣品時(shí)需注意以下幾點(diǎn):

● 確保樣品中無(wú)活菌繁殖;

● 細(xì)菌內(nèi)毒素值不會(huì)隨保存期而發(fā)生變化;

● 確保保存容器無(wú)細(xì)菌內(nèi)毒素污染,無(wú)細(xì)菌內(nèi)毒素吸附,不含影響檢測(cè)結(jié)果的洗脫物。

九、如何調(diào)節(jié)樣品的pH值?

如果樣品溶液的pH值不在6.08.0范圍內(nèi),則需要進(jìn)行調(diào)節(jié)以確保檢測(cè)準(zhǔn)確性。細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)的最佳pH值約為7.3,但由于鱟試劑中含有緩沖成分,此該檢測(cè)在pH6.08.0的范圍內(nèi)均可進(jìn)行。

對(duì)于可稀釋的樣品,可通過(guò)稀釋來(lái)調(diào)整pH值;對(duì)于不可稀釋的樣品,則可在樣品溶液中加入稀NaOHHCl溶液來(lái)調(diào)節(jié)pH值。

此外,也可利用緩沖液來(lái)稀釋樣品溶液。為確保調(diào)節(jié)效果,建議使用按需配制的NaOHHCl溶液來(lái)調(diào)整pH值。

十、檢測(cè)用試管可重復(fù)使用嗎?

檢測(cè)用試管不可重復(fù)使用。稀釋或樣品保存用試管可在進(jìn)行250℃超過(guò)30分鐘的干熱滅菌后重復(fù)使用。


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