在醫(yī)療產(chǎn)品的質(zhì)量保證過程中，無菌檢驗(yàn)是不可少的。對于腸外藥品來說，避免出現(xiàn)發(fā)熱原至關(guān)重要。這些致熱物質(zhì)（內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素）在標(biāo)準(zhǔn)滅菌過程中無法消除，一旦進(jìn)入血液就會產(chǎn)生生物活性，對人體健康造成危害，輕則引起輕微反應(yīng)（如發(fā)燒），重則導(dǎo)致膿毒性休克和死亡。因此，對注射制劑開展熱原檢測是不可少的流程。

一、熱原測試方法的演進(jìn)

自20世紀(jì)以來，熱原測試方法不斷發(fā)展。20世紀(jì)40年代，家兔熱原檢測（Rabbit Pyrogen Test，RPT）作為基于發(fā)熱反應(yīng)終點(diǎn)的體內(nèi)檢測方式出現(xiàn)。該方法通過向兔子耳靜脈注入試驗(yàn)物質(zhì)，監(jiān)測其直腸體溫變化來判斷是否存在熱原污染。

然而，RPT方法存在諸多局限性。它容易受到兔子飼養(yǎng)條件、種類差異等因素的干擾，無法檢測特定物質(zhì)，而且在醫(yī)療器械植入時容易出現(xiàn)局部反應(yīng)。此外，動物試驗(yàn)結(jié)果不能直接應(yīng)用于人體，但由于其能檢測未定性熱原，至今仍被視為熱原檢測的“黃金標(biāo)準(zhǔn)"。不過，這一方法在歐洲每年用于腸外藥物試驗(yàn)的兔子超過10,000只，給動物帶來了極大的壓力。

二、尋求替代：從3R戰(zhàn)略到新方法的探索

鑒于RPT方法的局限性，自1986年起，歐洲藥典委員會積極實(shí)施3R戰(zhàn)略，致力于開發(fā)替代方法。經(jīng)過多年努力，2021年歐洲藥典委員會決定在五年內(nèi)用先進(jìn)的體外檢測（如MAT）完-全取代RPT。2024年6月，該委員會正式批準(zhǔn)從所有條款中刪除家兔檢測，修訂文本將于2025年7月1日生效。

在RPT方法逐步被取代的過程中，鱟變形細(xì)胞裂解物（Limulus Amebocyte Lysate，LAL）檢測法成為熱原檢測的重要替代方法。該方法利用鱟血變形細(xì)胞提取物通過凝血技術(shù)檢測內(nèi)毒素，靈敏度高達(dá)0.005EU/ml，遠(yuǎn)高于兔熱原試驗(yàn)（0.5-3EU/ml）。隨著不斷改進(jìn)，從凝膠凝塊檢測法發(fā)展到濁度測定法和顯色鱟試劑檢測法，靈敏度可達(dá)0.001EU/ml。

但LAL檢測法也存在不少問題。它易受多種無害物質(zhì)影響而出現(xiàn)假陽性，只能檢測細(xì)菌內(nèi)毒素，無法檢測非內(nèi)毒素致熱原或其他污染物的增效作用，而且獲取鱟血淋巴會對馬蹄蟹種群產(chǎn)生影響。因此，人們?nèi)栽诓粩鄬ふ腋鼮槔硐氲臒嵩瓩z測方法。

三、新型檢測方法：重組試劑與單核細(xì)胞活化試驗(yàn)

2024年11月，《美國藥典-國家處方集》（USP-NF）正式納入了第86章“使用重組試劑的細(xì)菌內(nèi)毒素測試"，并宣布該章節(jié)于2025年5月起正式生效。其中，PyroSmartNextGen®重組鱟試劑作為全-球-首-款完整的重組級聯(lián)試劑（rCR），完-全模擬了天然鱟試劑LAL的酶聯(lián)反應(yīng)，剔除了容易引起假陽性的G因子，且不依賴鱟血，符合可持續(xù)發(fā)展的目標(biāo)。

盡管LAL檢測法在靈敏度等方面有所提升，但它更像是RPT的補(bǔ)充而非替代。因?yàn)槠渑c哺乳動物的熱原反應(yīng)機(jī)制存在差異，只能評估液體樣本中的細(xì)菌內(nèi)毒素，使用的系統(tǒng)也與哺乳動物系統(tǒng)不同，可能無法反映樣本的真實(shí)熱原潛力，所以和RPT一樣，LAL試驗(yàn)也不能完-全預(yù)測人體對試驗(yàn)物質(zhì)的反應(yīng)。

隨著對發(fā)熱反應(yīng)分子機(jī)制研究的深入，單核細(xì)胞活化試驗(yàn)（Monocyte-Activation Test，MAT）作為一種體外熱原檢測方法逐漸嶄露頭角。MAT利用人體全血與熱原接觸后產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF）來評估熱原污染，能模擬人體先天免疫系統(tǒng)反應(yīng)。它不僅能檢測各種熱原污染物，包括未定性熱原和非內(nèi)毒素，還能檢測塑料、金屬、植入物和醫(yī)療器械等固體材料。

MAT于2010年和2012年分別被納入《歐洲藥典》和《美國藥典》。該方法有多種變體，提供不同的人類單核細(xì)胞來源，如全血、分離的原始單核細(xì)胞（如PBMC）或單核細(xì)胞系。雖然相比rCR檢測法，MAT存在供體變異導(dǎo)致靈敏度偏差和檢測范圍較窄的問題，但可以對熱原進(jìn)行定量，且使用全血及其成分更可能再現(xiàn)體內(nèi)反應(yīng)。

盡管新鮮全血的可獲得性有限，但可以通過低溫保存的血液或白細(xì)胞介素(PBMC)來解決。驗(yàn)證研究表明，全血含有對熱原反應(yīng)的必要成分，且熱原刺激的分子機(jī)制已成功應(yīng)用于體外模型中。

四、總結(jié)：綜合選擇，保障用藥安全

在藥品生產(chǎn)過程中，熱原檢測對于保證腸外藥品、醫(yī)療器械、生物制劑等直接或間接進(jìn)入血液物質(zhì)的質(zhì)量與安全意義重大。家兔熱原試驗(yàn)（RPT）、鱟變形細(xì)胞裂解物（LAL）試驗(yàn)和單核細(xì)胞活化試驗(yàn)（MAT）各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體情況合理選擇檢測方法，以最-大-程-度保障患者用藥安全。