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鱟試劑法遭遇LER挑戰(zhàn),藥品安全信任鏈危矣?

發(fā)布時間: 2025-04-07  點擊次數(shù): 398次

近年來,隨著生物制劑復(fù)雜性的增加,內(nèi)毒素低回收率(Low Endotoxin Recovery,LER)現(xiàn)象對藥品安全檢測體系的挑戰(zhàn)愈發(fā)凸顯。FDA已強(qiáng)制要求制藥企業(yè)在提交生物制品上市申請(BLA)時,必須提供研究數(shù)據(jù)證明鱟試劑法(USP<85>)在特定時間段內(nèi)從加標(biāo)樣品中回收內(nèi)毒素的能力。這一舉措直指LER現(xiàn)象的核心矛盾——當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化鱟試劑(LAL)檢測因基質(zhì)干擾無法準(zhǔn)確回收內(nèi)毒素時,如何確保藥品的安全性未被系統(tǒng)性低估?

鱟試劑法遭遇LER挑戰(zhàn),藥品安全信任鏈危矣?


一、內(nèi)毒素低回收率現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與定義

內(nèi)毒素低回收率是指在藥品或制劑中,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化鱟試劑(LAL)檢測時,內(nèi)毒素控制標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)的回收率顯著低于預(yù)期的現(xiàn)象。該現(xiàn)象最早在含螯合緩沖液及聚山梨酸酯類輔料的單克隆抗體藥物研究中被發(fā)現(xiàn):當(dāng)LAL試劑與特定基質(zhì)接觸后,其對CSE的反應(yīng)性呈現(xiàn)溫度依賴性、瞬時且可重復(fù)的下降。

需注意的是,內(nèi)毒素"“CSE"存在本質(zhì)區(qū)別:內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌外膜的天然混合物,以囊泡形式存在;而CSE是通過人工純化的脂多糖(LPS),通常添加穩(wěn)定劑和賦形劑以延長保質(zhì)期。藥典內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品(RSE)和市售CSE主要用于校準(zhǔn)、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及藥典適用性研究。

二、LER的潛在機(jī)制:多因素綜合作用

盡管LER的確切機(jī)制尚未完-全明確,但研究提出了多因素綜合作用的假說:

1、電荷屏蔽效應(yīng)

LPSpH2時帶負(fù)電荷,可能與CSE和陽離子蛋白質(zhì)結(jié)合,掩蓋"LPS的作用,降低其可檢測性。

2、螯合劑影響

LAL試劑需要二價陽離子進(jìn)行反應(yīng),螯合劑可能封存這些陽離子,降低試劑活性。然而,研究表明添加Mg2+對恢復(fù)LER中的活動作用有限。

3、表面活性劑誘導(dǎo)的構(gòu)象改變

聚山梨醇脫氧膽酸鈉(Doc)和十二烷基硫酸鈉(SLS)等分散劑可使LPS膠束解離成更小的復(fù)合物或單體,降低其生物活性。有趣的是,這些膠束可能在去除洗滌劑后重新形成,恢復(fù)活性。

4、多因素綜合作用

最終LER機(jī)制可能是螯合劑類型和濃度、聚山梨酯類型和濃度以及蛋白質(zhì)離子性質(zhì)等多種因素共同作用的結(jié)果。

三、LER與檢測干擾的關(guān)聯(lián)性

LER屬于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(BET)中的抑制性干擾,需通過適用性測試排除。USP<85>要求將樣品稀釋至無干擾狀態(tài)以定量回收CSE活性,但未強(qiáng)制要求未稀釋產(chǎn)品的回收率達(dá)標(biāo)。

實際研究表明,即使通過適用性測試,含LER基質(zhì)的產(chǎn)品仍可能無法從原液中定量回收CSEFDA研究進(jìn)一步證實,LER現(xiàn)象廣泛存在于含螯合劑或表面活性劑的制劑中,且在加速穩(wěn)定性研究中,CSE加標(biāo)后的回收率隨時間推移呈現(xiàn)動態(tài)變化。

四、實驗設(shè)計的四重防線

實驗室可以制備內(nèi)毒素,但沒有標(biāo)準(zhǔn)方法,分析人員需保持方法清晰一致。

1、明確規(guī)定測試參數(shù)和驗收標(biāo)準(zhǔn):因為LAL試驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y-截距變異可能放大LER效應(yīng)。

2、加標(biāo)量需實測而非假設(shè):例如標(biāo)稱5EU/mL但實際僅1EU時,簡單計算可能導(dǎo)致錯誤結(jié)果。

3時效性管理:LER效應(yīng)具有時效性,動物試驗與體外檢測(如BET)需嚴(yán)格同步操作,避免因時間差導(dǎo)致結(jié)果偏差。

4、方法學(xué)選擇:考慮不同檢測方法(如LAL、配體、單核細(xì)胞活化試驗)間的差異。實驗室自制內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)化是另一難點?,F(xiàn)行指南要求其活性需與RSE/CSE在動力學(xué)參數(shù)(起始時間、反應(yīng)斜率等)上一致,但凍干制劑與溶液態(tài)內(nèi)毒素的效價定義差異(EU/ngEU/mL)增加了比對難度。

*活性與效價的區(qū)別:活性以濃度表示,通常為EU/mL,或在RSE的情況下為EU/瓶。購買的CSE以凍干制劑形式提供,按重量填充,通常為ng/vial。

效價定義為CSE的特定活性,即活性/單位重量,通常為EU/ng,效價測定是將重構(gòu)CSE的重量單位(ng/mL)與重構(gòu)RSE的活性單位(EU/mL)關(guān)聯(lián),得出以EU/ng為單位的CSE效力的方法。

五、LER對藥品安全性評估的影響

盡管FDA數(shù)據(jù)顯示,2004-2015年間僅5次生物制品召回涉及實際安全問題,且均與LER無關(guān),但監(jiān)管層仍強(qiáng)調(diào)需優(yōu)先采用與RSE/CSE特性匹配的實驗室自制內(nèi)毒素進(jìn)行方法驗證。這一策略的邏輯在于:若LER源于CSE與天然內(nèi)毒素的差異,則通過匹配二者理化特性的加標(biāo)物,可最大限度模擬真實污染場景,從而避免假陰性風(fēng)險。

六、結(jié)論

LER現(xiàn)象揭示了標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)毒素(CSE)與天然內(nèi)毒素在理化性質(zhì)及基質(zhì)相互作用上的本質(zhì)差異,盡管其可能導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測結(jié)果被低估,但現(xiàn)有證據(jù)表明并不直接威脅藥品安全性,制藥行業(yè)需在確保檢測科學(xué)性的前提下,持續(xù)探索機(jī)制并優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn),以平衡LER風(fēng)險與檢測效率,鞏固鱟試劑法(LAL試驗)作為內(nèi)毒素質(zhì)量控制核心檢測工具的地位

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